Spectrophotométrie

Spectrophotométrie

Loi de Beer-Lambert

A = ε × l × c. A = absorbance (sans unité, = DO densité optique). ε = coefficient d'extinction molaire (L.mol⁻¹.cm⁻¹). l = trajet optique (cm). c = concentration (mol/L).

Transmittance et absorbance

• T = I/I₀ (fraction de lumière transmise). A = -log(T) = log(I₀/I).
• A = 0 → T = 100% (transparent). A = 1 → T = 10%. A = 2 → T = 1%.
• Validité de Beer-Lambert : solutions diluées (A < 2), lumière monochromatique, pas d'interaction entre molécules.

Applications

• Dosage enzymatique : NADH absorbe à 340 nm (ε = 6220). NAD⁺ n'absorbe pas → suivi de l'activité enzymatique.
• Dosage des protéines : UV à 280 nm (Trp, Tyr). Bradford (595 nm). BCA (562 nm).
• Dosage ADN : UV à 260 nm. Ratio A260/A280 ≈ 1.8 (ADN pur). < 1.8 = contamination protéique.